納米抗體制備流程詳解

1.什么是納米抗體

納米抗體是由比利時科學(xué)家于1993年在自然雜志中首次報道。傳統(tǒng)抗體分子(IgG)是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成的結(jié)構(gòu)比較保守的抗體分子。抗體分子的輕鏈包含1個VL區(qū)和1個CL區(qū)，而重鏈則擁有1個VH區(qū)和3個CH區(qū)(CH1、CH2和CH3)。

羊駝只有重鏈抗體缺少輕鏈，由4個HC和2個VH組成，其中VHH區(qū)域又被稱為納米抗體或單域抗體（single domain antibody，sdAb），納米抗體（Nanobody, Nb）晶體為2.5nm，長4nm，分子量只有15KDa。納米抗體主要用于生物醫(yī)藥研發(fā)（基因工程藥物研發(fā)、ADC藥物研發(fā)）；用于臨床體外診斷（膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)發(fā)光法）；用于腫瘤研究、免疫學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，目前CAR-T治療型抗體開發(fā)受到越來越多科研工作者的關(guān)注。

2.納米抗體的優(yōu)缺點

2.1 納米抗體的優(yōu)點

（1）在高溫和pH下的穩(wěn)定性；

（2）VHH可以識別通常不被常規(guī)抗體識別的抗原位點；

（3）它們的小分子片段有助于快速組織滲透和標(biāo)記應(yīng)用，包括跨越血腦屏障；

（4）用于大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)約成本的替代品。

2.2納米抗體的缺點

納米抗體（VHH抗體）由于分子量較小，約為15kDa，相當(dāng)于傳統(tǒng)IgG抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)，因此針對VHH抗體的二抗不具有普遍適用性，需要將VHH融合Fc片段進行共表達進行解決二抗識別問題（卡梅德生物提供多種抗羊駝二抗，可用于免疫血清效價檢測，Cat.#：SPAB01，SPAB03）

3.納米抗體（VHH抗體）主要應(yīng)用方向

基于納米抗體優(yōu)良的性能，目前被廣泛應(yīng)用于CAR-T治療型抗體開發(fā)。

CAR-T療法是嵌合抗原受體T細胞免疫療法，這是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法。通過基因工程技術(shù)，將T細胞激活，并裝上定位導(dǎo)航裝置CAR（腫瘤嵌合抗原受體），將T細胞這個普通“戰(zhàn)士”改造成“超級戰(zhàn)士”，即CAR-T細胞，他利用其“定位導(dǎo)航裝置”CAR，專門識別并消滅體內(nèi)腫瘤細胞，從而達到腫瘤治療的目的。

4.卡梅德生物能夠為客戶提供高質(zhì)量的駝源納米抗體開發(fā)服務(wù)

卡梅德生物可以提供多種駝源納米抗體開發(fā)服務(wù)，包括羊駝、大羊駝、駱駝、美洲駝等，基于噬菌體展示技術(shù)平臺，卡梅德生物可以提供包括抗原設(shè)計、羊駝免疫、文庫構(gòu)建與篩選、活性功能驗證等主要實驗環(huán)節(jié)，并為全球的科學(xué)家提供高特異性和高親和力的羊駝VHH抗體。

5.卡梅德生物為客戶提供駝源抗體開發(fā)的全流程介紹

主要包括以下步驟:羊駝免疫，噬菌體文庫構(gòu)建，抗體庫篩選，抗體表達與功能驗證。 

5.1羊駝免疫

卡梅德生物提供健康的成年羊駝（28-36月大）進行免疫，約16-20周即可獲得高質(zhì)量的文庫和單抗細胞株，交付完整的實驗過程記錄和免疫動態(tài)視頻。卡梅德生物根據(jù)客戶的抗原類型，會制定特定的免疫抗原制備方案以及免疫方案。

5.1.1抗原準(zhǔn)備：客戶提供抗原，弗氏佐劑的使用量是1ml，將抗原和佐劑以1:1混合進行免疫。

5.1.2羊駝免疫:免疫5次，每次間隔20天，在羊駝頸部進行注射，免疫后1小時觀察羊駝是否有不適癥狀。 

5.1.3采血：免疫前進行采血，留作陰性對照，在第三、第四次免疫后間隔一星期進行采血5ml效價測定，ELISA檢測血清效價，效價滿足要求＞10⁵。卡梅德生物為客戶提供清晰的免疫時間節(jié)點信息表，如表1所示：

表1：卡梅德生物納米抗體制備免疫時間進程舉例

5.1.4PBMC細胞分離：取外周血100-120mL，PBMC細胞總數(shù)為4*10⁷-10⁸個，全部郵寄給客戶。

5.2噬菌體文庫構(gòu)建

卡梅德生物使用M13噬菌體的pIII蛋白進行VHH抗體（納米抗體）表面展示，制備TG1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，構(gòu)建噬菌體載體，并進行噬菌體庫容測定。

5.2.1RNA提?。?/span>按照商業(yè)化試劑盒操作進行RNA提取。

5.2.2CDNA反轉(zhuǎn)錄合成：按照商業(yè)化試劑盒操作進行cDNA制備。

5.2.3PCR擴增：以cDNA為模板，PCR擴增重鏈抗體基因可變區(qū)，擴增2輪。

5.2.4連接載體并電轉(zhuǎn)化：酶切、連接噬菌粒載體，電擊轉(zhuǎn)化TG1宿主菌，構(gòu)建抗體庫。

5.2.5細菌文庫/噬菌體文庫建立：計算庫容量，庫容量交付標(biāo)準(zhǔn)10⁸～10⁹。

5.3抗體庫篩選

常規(guī)使用的篩選方法是固相篩選，磁珠和細胞篩選（常用于GPCR，離子通道受體的抗體篩選）。

卡梅德生物為客戶提供定制化的篩選體系，根據(jù)客戶的需求不同，我們提供固相篩選，固相/液相篩選以及細胞篩選的方法。前兩者適用于蛋白，多肽一類靶抗原的篩選；第三種適用于GPCR，離子通道受體的抗體篩選。通過不同的篩選方法，可以為客戶高效的篩選出不同類型的阻斷型抗體

5.4抗體表達與功能驗證

5.4.1表達：構(gòu)建哺乳表達體系進行抗體表達，卡梅德建立了完善的哺乳表達體系，包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等細胞系，配合卡梅德設(shè)計的高表達載體（含有全長的CMV啟動子以及優(yōu)化后的分泌信號肽序列）進行重組抗體表達與制備。

5.4.2純化：納米抗體過鎳柱純化。

5.4.3親和力測定：將純化好的納米抗體進行Biacore親和力檢測。