熒光定量技術(shù)服務項目介紹
Real Time PCR法是實時監(jiān)測解析PCR擴增量的方法。因其無需電泳，大大減低了實驗污染的機率，且具有快速、可對檢測靶基因定量而倍受青睞。實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重復性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞、細菌等mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果。我們?yōu)槟峁┤讓崟r熒光定量PCR技術(shù)及解析服務：您只需提供組織或細胞標本，我們?yōu)槟瓿蒖NA抽提，cDNA制備，實時定量PCR，標準曲線制備及數(shù)據(jù)分析的所有步驟。
一、配套設備
1、熒光定量PCR儀
ABI 7900熒光定量PCR儀
Lightcycler 240熒光定量PCR儀
2、離心機
Heras低溫高速離心機
Beckman低溫高速離心機
二、檢測方法
1、TaqMan探針方法
該技術(shù)以美國 ABI 公司為代表。 PCR 擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸片斷，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號（圖4）。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
2、SYBR Green I嵌合熒光法
SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理：SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖2）。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。
SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對PCR引物設計的特異性和PCR反應的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。
三、服務項目
1、定性分析
PCR反應結(jié)束后的PCR產(chǎn)物無需電泳檢測，可以通過Real Time PCR方法，簡單快速地對目的基因進行高特異性、高靈敏度的檢測，同時閉管操作的實時檢測可以有效防止反應產(chǎn)物的污染。本技術(shù)可以廣泛應用于病毒、病原菌等致病微生物的檢測以及各種生物品種的鑒定等。
2、絕對定量
絕對定量首先必須構(gòu)建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標準品。使用已知濃度的標準品制作5 個點以上的標準曲線后，可以使用標準曲線對未知濃度的檢測樣品進行絕對量（起始拷貝數(shù)）分析。
3、相對定量（mRNA表達量分析）
基因表達的研究一般采用相對定量的方法。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內(nèi)標同時分別進行定量，然后求出對于參比基因的目的基因的相對量。通過對樣品間的目的基因的相對量進行比較，可以對不同樣品間的mRNA進行表達量分析。參比基因通常選用β-actin。通過同時對參比基因的實時檢測，可以對樣品之間由于起始細胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進行校正，達到在嚴格意義上對樣品之間的mRNA表達量進行分析之目的。
四、服務流程
1、 客戶以電話或郵件形式告知公司要進行的實驗基因名稱和標本數(shù)目；
2、 公司派專業(yè)技術(shù)人員與您洽談實驗費用和熒光定量探針設計方案（序列和設計有公司負責）；
3、 簽訂實驗技術(shù)服務合同，交費用的30%作為訂金（若實驗沒有結(jié)果或結(jié)果未達到客戶要求，訂金不退）；
4、 公司合成熒光定量探針、派相關(guān)人員取回實驗標本；
5、 進行RNA抽提、鑒定、cDNA合成實驗；
6、 進行實時熒光定量PCR實驗（每個標本的每個基因均進行3倍平行孔實驗，保證獲得準確、無誤差、客觀的樣品基因擴增數(shù)據(jù)）；
7、 通過統(tǒng)計分析軟件計算目的基因的mRNA表達數(shù)據(jù)；
8、 提供完整的實驗報告（實時熒光擴增曲線圖、分析數(shù)據(jù)、實驗步驟、試劑儀器）；
9、 客戶交齊全額費用。
五、服務要求
1、請認真填寫Real Time PCR檢側(cè)技術(shù)服務委托單；
2、 請您提供新鮮的且盡量多的材料（各種材料的 RNA 提取量請參照“總 RNA 的提取”），或直接提供純化好的總RNA（大于5µg/樣品）；（各種材料的 DNA 提取量請參照“ D NA 的提取”），或直接提供純化好的DNA（大于5µg/樣品) ；
3、如果提供的材料為細胞或組織，應保證材料新鮮：
細胞樣品：細胞培養(yǎng)至少達105以上，培養(yǎng)后細胞請勿做任何處理。
組織樣品：離體后30分鐘內(nèi)入液氮保存，動物組織為5mg以上。
血液樣品：分離白細胞后，-70℃保存。
4、 請通過 E-mail 提供已知的全長基因序列；
5、 請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料： DNA/ RNA 來源、豐度等。
六、收費標準及交貨期限
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服務內(nèi)容
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樣品數(shù)量
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價格
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相關(guān)要求
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實驗結(jié)果
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探針的設計和篩選（TaqMan法）
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2200元/條
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客戶提供基因序列
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合成好的引物、探針。
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引物的設計和篩選（SybrGreen法）
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700元/條
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客戶提供基因序列
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合成好的引物。
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基因組DNA提取
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1-9個
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100元/個
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組織：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量500mg以上，剩下歸還（無致病性，除脂肪組織、粘液狀組織以外）。（新鮮，10mg）
細胞：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量105以上植物：提供樣品量500mg以上（新鮮葉片，或4℃保存一周內(nèi)的葉片），剩下歸還（新鮮組織，植物干粉得率較低）
原核生物：提供樣品量108CFU或者0.5個麥氏單位以上（非致病性，提供菌株和培養(yǎng)基信息；致病性，提供滅活菌液等）
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得到基因組DNA，純度（OD260/OD280=1.6-1.8），提供基因組凝膠電泳照片。
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10-49個
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80元/個
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50個以上
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50元/個
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基因組RNA提取
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1-9個
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300元/個
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組織：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量500mg以上，剩下歸還（無致病性，除脂肪組織、粘液狀組織以外）。
細胞：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量105以上
植物：提供樣品量500mg以上（要新鮮葉片，或4℃保存一周內(nèi)的葉片），剩下歸還。
原核生物：提供樣品量108CFU或者0.5個麥氏單位以上
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得到RNA純度（OD260/OD280=1.8-2.0）條帶清晰，提供電泳照片，無基因組污染。
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10-19個
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200元/個
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20-49個
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160元/個
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50個以上
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100元/個
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反轉(zhuǎn)錄
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1-9個
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300元/個
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提供純化好的、未降解的總RNA 5μg
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cDNA，提供40μl，2μl夠用一次反轉(zhuǎn)錄時oligo dT和Random Primer客戶任選
PCR檢測采用內(nèi)參引物。
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10-19個
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200元/個
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20-49個
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160元/個
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50個以上
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100元/個
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PCR條件優(yōu)化（TagMan法）
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600元/個
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PCR條件優(yōu)化（SybrGreen法）
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400元/個
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PCR反應
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1-9個
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40元/個
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客戶提供模板和引物，并告知濃度、產(chǎn)物大小等信息。
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與模板和引物相關(guān)。
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10-49個
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30元/個
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50-100個
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10元/個
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100個以上
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6元/個
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質(zhì)粒構(gòu)建
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600元/次
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RT-PCR反應
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1-3個
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240元/個
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客戶按要求提供試驗樣本（詳見基因組DNA提取、基因組RNA提取和反轉(zhuǎn)錄樣品要求）；或提供純化好的DNA樣品5μg
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4-19個
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200元/個
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20個以上
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160元/個
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50個以上
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100元/個
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注：1、以上技術(shù)服務報價是針對Human、Mouse、Rat三種生物種的報價。如果是三種生物種以外的物種時，價格請具體垂詢!
2、如因非本公司原因造成某實驗步驟失敗，使實驗提前終止，已啟動的實驗項目仍正常收費。
3、內(nèi)參的GAPDH和β-actin引物探針免費，標準曲線免費贈送。
4、內(nèi)參：哺乳動物內(nèi)參還有 GAPDH基因和β-actin基因。細菌內(nèi)參16S rDNA基因，植物的內(nèi)參為actin基因。
4、內(nèi)參：哺乳動物內(nèi)參還有 GAPDH基因和β-actin基因。細菌內(nèi)參16S rDNA基因，植物的內(nèi)參為actin基因。